Cấy ria (vi sinh vật học)

Đối với các định nghĩa khác, xem Streak.

Một đĩa thạch đã được cấy ria cho thấy các khuẩn lạc thưa dần khi đường cấy di chuyển theo chiều kim đồng hồ.

Trong vi sinh vật học, cấy ria (tiếng Anh: streaking) là một kỹ thuật cơ học được sử dụng để phân lập một chủng thuần khiết từ một loài vi sinh vật đơn lẻ, thường là vi khuẩn. Các mẫu từ một khuẩn lạc có nguồn gốc từ một tế bào duy nhất được lấy từ đĩa đã cấy ria để tạo ra một môi trường nuôi cấy vi sinh vật đồng nhất về mặt di truyền trên một đĩa mới, nhằm mục đích định danh, nghiên cứu hoặc thử nghiệm sinh vật đó. Có thể sử dụng nhiều kiểu đường ria khác nhau để cấy đĩa. Tất cả đều liên quan đến việc pha loãng vi khuẩn bằng cách cấy ria chúng một cách có hệ thống trên bề mặt thạch agar trong đĩa Petri để thu được các khuẩn lạc riêng rẽ chứa số lượng tế bào ít dần một cách tuần tự. Nếu trên bề mặt thạch agar phát triển các vi sinh vật có vật chất di truyền giống hệt nhau, thì môi trường nuôi cấy đó được coi là một môi trường nuôi cấy vi sinh thuần khiết. Mặc dù cấy ria thủ công là một kỹ năng nền tảng, các phòng xét nghiệm đang bắt đầu áp dụng các hệ thống cấy ria tự động để cải thiện hiệu quả và tính nhất quán.

Lịch sử ra đời

Ảnh Robert Koch: nhà vi sinh vật học người Đức và là người phát triển kỹ thuật cấy ria hiện đại.

Phương pháp cấy ria hiện đại được phát triển vào những năm 1880 từ nỗ lực của Robert Koch và các nhà vi sinh học khác nhằm thu được môi trường nuôi cấy vi sinh để nghiên cứu chúng. Thời điểm đó, Julius Richard Petri (trong vai trò trợ lý cho Koch) đã phát minh ra đĩa nuôi cấy mà sau này được đặt theo tên ông. Trước khi áp dụng kỹ thuật cấy ria, phương pháp đổ đĩa là kỹ thuật phổ biến được các nhà vi sinh học sử dụng để thu được chủng thuần khiết. Phương pháp pha loãng hay phân lập bằng cấy ria lần đầu tiên được phát triển tại phòng thí nghiệm của Koch bên cạnh hai người trợ lý Friedrick Loeffler và Georg Theodor August Gaffky của ông.

Kỹ thuật

Cấy ria là một quy trình nhanh chóng và đơn giản để phân lập vi sinh vật thông qua pha loãng liên tiếp. Kỹ thuật này được thực hiện bằng cách giảm nồng độ vi khuẩn tương đối lớn xuống nồng độ nhỏ hơn. Việc giảm nồng độ vi khuẩn sẽ giúp các khuẩn lạc trải rộng vừa đủ và cho phép tách biệt các loại vi sinh vật khác nhau trong mẫu bệnh phẩm. Cấy ria được tiến hành bằng dụng cụ tiệt trùng và kỹ thuật vô trùng, chẳng hạn như tăm bông hoặc phổ biến hơn là que cấy vòng. Nếu sử dụng que cấy vòng kim loại, trước tiên nó được tiệt khuẩn bằng cách đốt qua ngọn lửa. Khi que cấy đã nguội, nó được nhúng vào chất cấy (inoculum), ví dụ như môi trường nuôi cấy vi sinh hoặc bệnh phẩm của bệnh nhân chứa nhiều loài hay một số lượng lớn vi khuẩn. Kỹ thuật vô trùng được áp dụng để duy trì môi trường nuôi cấy vi sinh và ngăn ngừa tạp nhiễm môi trường nuôi cấy.

Những ví dụ ban đầu của kỹ thuật cấy ria di chuyển theo một hướng duy nhất trên đĩa, trái ngược với kỹ thuật "zig zag" qua lại được ưa chuộng ngày nay. Nhiều phương pháp khác nhau đã được phát triển để cấy ria một đĩa thạch. Việc lựa chọn một kỹ thuật là tùy theo sở thích cá nhân và cũng có thể phụ thuộc vào số lượng vi sinh vật mà mẫu chứa.

Một đĩa thạch minh họa các bước của kỹ thuật cấy phân bốn vùng.

Kiểu cấy ria được sử dụng phổ biến nhất là cấy phân bốn vùng (Quadrant streaking), còn được gọi là "cấy ria bốn vùng" và "phương pháp cấy ria bốn hướng" Kỹ thuật này bao gồm việc chia đĩa thạch thành bốn vùng, hay bốn góc phần tư. Để bắt đầu, một que cấy vòng tiệt trùng được đặt vào góc phần tư thứ nhất của đĩa và di chuyển qua lại nhiều lần trên bề mặt đĩa thạch từ phía ngoài đĩa vào trung tâm. Sau khi hoàn thành mỗi phần trước, đĩa được xoay 90 độ và phải sử dụng một que cấy vòng mới đã được vô trùng. Bắt đầu từ phần cuối của góc phần tư trước, que cấy vòng được kéo nhẹ nhàng qua một nửa các đường cấy của vùng một trước khi tiếp tục cấy sang vùng tiếp theo. Quy trình này lặp lại tuần tự qua cả bốn vùng và sẽ cho kết quả là phần cuối cùng chứa khu vực được pha loãng nhiều nhất.

Hình minh họa quy trình cấy ria trên đĩa thạch để thu được các khuẩn lạc riêng rẽ bằng kỹ thuật vô khuẩn.

Kiểu cấy phân ba vùng, hay còn gọi là cấy ria chữ T, được khuyến nghị cho người mới tập làm. Tuy nhiên, nó cũng bị hạn chế trong các ứng dụng cần sử dụng nhiều hơn một mẫu nuôi cấy. Đĩa được chia bằng cách vẽ một chữ "T" để tạo ra ba vùng riêng biệt. Xoay đĩa sao cho đỉnh của chữ "T" xa tay thuận của bạn nhất. Bắt đầu từ vùng đầu tiên này, một que cấy vòng đã tiệt trùng được kéo qua bề mặt thạch agar theo chuyển động zigzag qua lại cho đến khi phủ được khoảng một phần ba đĩa. Sau đó, que cấy được tiệt trùng lại và đĩa được xoay 90 độ. Bắt đầu từ vùng đã được cấy trước đó, que cấy được kéo qua nó hai đến ba lần, tiếp tục kiểu zig zag trước khi chuyển sang phủ vùng thứ hai. Quy trình này sau đó được lặp lại một lần nữa, cẩn thận không chạm vào các vùng đã cấy trước đó. Mỗi lần như vậy, que cấy lại thu thập được ít vi khuẩn hơn cho đến khi chỉ còn lấy được từng tế bào vi khuẩn riêng rẽ có thể phát triển thành một khuẩn lạc. Đĩa thạch sẽ cho thấy sự phát triển dày đặc nhất ở vùng đầu tiên. Vùng thứ hai sẽ ít phát triển hơn và có một vài khuẩn lạc riêng rẽ, trong khi vùng cuối cùng sẽ có ít sự phát triển nhất và nhiều khuẩn lạc được phân lập.

Hình minh họa mẫu được sử dụng cho kỹ thuật cấy ria liên tục.

Để sử dụng cho cả pha loãng và môi trường nuôi cấy thuần, cấy ria tỏa tia (radiant streaking) bắt đầu bằng việc cấy một phần nhỏ thạch ở một bên của đĩa bằng que cấy vòng tiết trùng. Từ phần đã cấy ở bên đó, thực hiện một loạt các đường dọc cắt ngang đĩa kéo dài sang phía bên kia theo kiểu hình nan quạt. Sau đó chuyển sang một que cấy vòng đã tiệt trùng mới và tạo các đường ngang cắt ngang qua các đường dọc khi bạn di chuyển dần xuống đĩa.

Cấy ria liên tục (continuous streaking) là một phương pháp được dùng để trải đều mẫu bệnh phẩm trên khắp đĩa nhằm tăng sinh, hay làm tăng quy mô của môi trường nuôi cấy. Phương pháp này được thực hiện bằng cách bắt đầu từ bên ngoài và di chuyển vào phía trong của đĩa chỉ trong một động tác. Phương pháp này nhanh nhưng chỉ áp dụng được cho các mẫu rất loãng hoặc trong trường hợp đã thu được chủng thuần. Ở những phòng xét nghiệm muốn tiết kiệm vật tư, một đĩa thạch có thể được chia thành các phần và sử dụng kiểu cấy ria liên tục cho một loại vật liệu khác nhau ở mỗi phần, qua đó cho phép cấy số lượng mẫu tối đa trong một lần.

Một phương pháp liên tục khác là cấy ria zig zag cũng được dùng để tăng sinh mẫu nuôi cấy. Bắt đầu từ phía xa tay thuận nhất, di chuyển que cấy vòng đã tiệt trùng qua lại trên khắp đĩa. Sử dụng các động tác rộng trên toàn bộ chiều rộng của đĩa để bao phủ diện tích lớn nhất của bề mặt thạch agar.

Cấy ria tự động

Mục tiêu chính của kỹ thuật này là thu được mẫu bệnh phẩm thuần bằng cách phân lập một loại vi sinh vật duy nhất từ một quần thể hỗn hợp. Các chuyên gia sử dụng phương pháp cấy ria trên đĩa thạch để tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ, biệt lập trên bề mặt thạch. Quá trình này bao gồm việc pha loãng chất cấy vi khuẩn trên môi trường cho đến khi các tế bào cách nhau đủ xa để phát triển thành các cụm biệt lập. Để đạt được kết quả tốt nhất, các nhà lâm sàng thường áp dụng phương pháp cấy bốn vùng. Kỹ thuật này yêu cầu xoay đĩa petri và tiệt trùng que cấy giữa các vùng, làm loãng nồng độ vi khuẩn một cách có hệ thống. Ngay khi một khuẩn lạc riêng rẽ được chọn và cấy chuyển, môi trường nuôi cấy đó được coi là môi trường nuôi cấy vi sinh thuần, đây là yêu cầu cơ bản cho các xét nghiệm tiếp theo một cách chính xác. Việc tích hợp các hệ thống theo dõi hiện đại vào quy trình này, chẳng hạn như Previ Isola (một hệ thống tự động tiêu chuẩn cho việc cấy mẫu và theo dõi phân lập trước đó), là rất quan trọng. Sử dụng các hệ thống này mang lại lợi ích vì nó chuẩn hóa quy trình cấy, giảm thiểu sai sót của con người và đảm bảo các bệnh phẩm dịch cơ thể được xử lý với độ tái lặp cao. Mặc dù các phương pháp thủ công mang tính truyền thống, nghiên cứu cho thấy cấy ria tự động có thể tăng sản lượng khuẩn lạc biệt lập và cải thiện tính nhất quán so với các phương pháp cấy ria thủ công. Điều quan trọng cần nhớ là mục tiêu của sự chính xác này là xác định vi sinh vật gây nhiễm bệnh, tạo điều kiện điều trị kháng sinh đích. Một nhược điểm của cấy ria thủ công là mất nhiều thời gian để thành thạo và thực hiện. Tuy nhiên, khi so sánh giữa thao tác thủ công và hệ thống tự động, mặc dù thời gian cấy ria thực tế có thể tương đương, tính nhất quán do tự động hóa mang lại thường dẫn đến ít phải làm lại hơn. Cuối cùng, đĩa cấy ria vẫn là chuẩn mực để tách các hỗn hợp phức tạp thành các thành phần có thể nghiên cứu được, bởi vì không có sự phân lập thì không thể xác định được chẩn đoán.

Môi trường nuôi cấy

Đĩa dùng để cấy ria mẫu là đĩa Petri chứa môi trường nuôi cấy. Vi khuẩn cần các chất dinh dưỡng khác nhau để phát triển, gồm nước, nguồn năng lượng, nguồn carbon, nitơ, các khoáng chất bổ sung, yếu tố tăng trưởng và các vitamin đặc hiệu cho từng loại vi khuẩn. Một loại môi trường rất phổ biến được sử dụng trong các phòng xét nghiệm vi sinh là agar - một chất giống như gelatin có nguồn gốc từ rong biển. Môi trường agar dinh dưỡng tạo ra một chất nền tiệt trùng, trong suốt, có thể chịu được nhiệt độ cao của quá trình ủ vi khuẩn mà vẫn giữ được hình dạng. Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy nào phụ thuộc vào vi sinh vật đang được nuôi cấy hoặc được chọn lọc. Môi trường chọn lọc cũng có thể được sử dụng để phân lập vi khuẩn. Bằng cách thêm một chất ức chế như kháng sinh vào môi trường, có thể ngăn chặn các chủng vi khuẩn không mong muốn phát triển trên đĩa.

Ủ ấm

Các phòng xét nghiệm khác nhau có tiêu chuẩn khác nhau về hướng và kiểu cấy ria.

Tùy thuộc vào chủng, đĩa đã cấy ria sau đó có thể được ủ ấm, thường từ 24 đến 46 giờ, để vi khuẩn sinh sôi. Một số chủng vi khuẩn, ví dụ như các loài Bartonella cần thời gian ủ dài hơn do tốc độ tăng trưởng chậm. Trong quá trình ủ, các đĩa được duy trì ở nhiệt độ không đổi trong phòng xét nghiệm. Thông thường, các môi trường nuôi cấy được giữ ở nhiệt độ gần 25°C, nhiệt độ phòng tiêu chuẩn. Tuy nhiên, một số vi sinh vật đòi hỏi ủ ở nhiệt độ khác, đặc trưng cho phạm vi tốc độ tăng trưởng cao và khả năng sống sót của chúng, điều này cần được tính đến. Khi thiết lập ủ, đậy nắp đĩa petri và lật ngược đĩa lại, vùng thạch đã cấy ria nên nằm ở phía trên. Làm như vậy để bất kỳ lượng nước ngưng tụ nào hình thành trong quá trình sẽ không rơi xuống vi khuẩn đang phát triển. Cuối thời gian ủ, cần có đủ vi khuẩn để tạo thành các khuẩn lạc hữu hình ở những vùng mà que cấy vòng đã chạm vào. Từ những khuẩn lạc hỗn hợp này, có thể định danh các loài vi khuẩn hoặc nấm riêng lẻ dựa trên sự khác biệt về hình thái (kích thước/hình dạng/màu sắc) của chúng. Sau đó, có thể cấy chuyển sang một đĩa môi trường mới để thu được môi trường nuôi cấy thuần khiết phục vụ cho các phân tích tiếp theo.

Tầm quan trọng

Sử dụng phương pháp cấy ria trên đĩa thạch để thu được chủng vi khuẩn thuần nhất là kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học như bệnh học, phân loại học và sinh thái học. Trong tự nhiên, vi khuẩn thường tồn tại ở dạng quần thể hỗn hợp. Để có thể nghiên cứu các đặc tính gây bệnh, hình thái học và sinh lý học của một loài cụ thể, vi khuẩn đó cần phải được phân lập thành các chủng thuần, đồng nhất về mặt di truyền. Kỹ thuật cấy ria vi sinh vật thường xuyên được áp dụng trong nghiên cứu bệnh truyền nhiễm. Đĩa thạch cấy ria cho phép phân tích mức độ nhạy cảm với kháng sinh (kháng sinh đồ) và giải trình tự bộ gen để phân tích cấu trúc di truyền đặc trưng của một chủng. Ngoài ra, kỹ thuật này cũng được ứng dụng trong quá trình biến nạp – một phương pháp biến đổi các tính trạng của vi khuẩn bằng cách thêm hoặc bớt các gen cụ thể.

Xem thêm

• Thảm vi khuẩn

Liên kết ngoài

• Phương pháp cấy ria thạch agar Lưu trữ ngày 27 tháng 11 năm 2007 tại Wayback Machine để thu các khuẩn lạc riêng rẽ (video).